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RT-PCRについて

抽出したRNAからRT-PCRでcDNAを作成する際に、原核生物の場合はoligoーdT primerはpoli(A)-tail
が存在しないので、利用できないと書いてあったのですが、実際手違いで利用したところなぜかmRNAを取り出すことができました。これはもしかしたらpoli(A)-tailが存在するかもしれないということなのでしょうか?
この理由について知りたいのですが、回答よろしくお願いします。

投稿日時 - 2006-04-01 11:55:25

QNo.2064764

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回答(4)

ANo.4

>ゲノムDNAのコンタミを増幅した可能性を排除するにはとりだしたmRNAをcDNAにせずPCRをすればよいのでしょうか?

そうですね。これはRT-PCR実験のときは必ずとるべきコントロールです。

または、Adaptorつきのoligo-dTを使っているなら、目的の遺伝子特異的プライマーとアダプタープライマーの組み合わせで確かめるとか(つまりRACEです)。それでももし増えてくるなら、その産物をシークエンスしてなにが起こっているか確かめてください。
もしその結果が、原核生物のpoly-A付加の可能性を示すものなら、、、大発見です。

投稿日時 - 2006-04-01 22:28:42

お礼

貴重なご意見ありがとうございました。参考にさせていただきます。ちょっとやる気がでてきました。

投稿日時 - 2006-04-01 22:51:56

ANo.3

AT-richな配列にmis-annealして逆転写が始まる可能性はありますが、原核生物ではoligo-dT primerで逆転写が起こるとはないと考えていいと思います。

>mRNAの確認として、cDNAに含まれていると考えられる配列をPCRで増幅させ、アガロースゲル電気泳動でバンドを確認しました。

ゲノムDNAのコンタミを増幅した可能性は排除できますか? 逆転写なしのnegative conrolの結果は?

投稿日時 - 2006-04-01 22:04:51

補足

ゲノムDNAのコンタミを増幅した可能性を排除するにはとりだしたmRNAをcDNAにせずPCRをすればよいのでしょうか?

投稿日時 - 2006-04-01 22:14:45

「mRNAが取り出せた」というのはどうやって確認したのですか?
特定のcDNAがPCRで検出できたということですか?

投稿日時 - 2006-04-01 14:28:42

補足

mRNAの確認として、cDNAに含まれていると考えられる配列をPCRで増幅させ、アガロースゲル電気泳動でバンドを確認しました。

投稿日時 - 2006-04-01 21:26:36

ANo.1

数bp連続したAがあり、
そこにオリゴdTが結合したのではないでしょうか。
回収した配列を使って3'RACEはやりましたか?

それで本当にpolyA tailがあるのかが分かると思います。

投稿日時 - 2006-04-01 12:51:03

補足

3’RACEはしていません。それについても検討して今後の実験に役立てたいと思います。回答どうもありがとうございました。

投稿日時 - 2006-04-01 22:13:17

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